Lielākajai daļai vīrusu genoma secības ir zināmas.Nukleīnskābju zondes, kas ir īsi DNS segmenti, kas paredzēti hibridizācijai ar komplementāriem vīrusa DNS vai RNS segmentiem.Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir efektīvāka vīrusu noteikšanas metode.Nesen ir izstrādātas augstas caurlaidības diagnostikas metodes.
A. Nukleīnskābju hibridizācijas tehnika
Nukleīnskābju hibridizācija, galvenokārt ietverot Southern blotēšanu (dienvidu) un Northern blotēšanu (ziemeļu), ir strauji attīstās jauna metode vīrusu diagnostikas jomā.Hibridizācijas testa pamatojums ir izmantot īsus DNS segmentus (sauktus par “zondi”), kas paredzēti hibridizācijai ar komplementāriem vīrusa DNS vai RNS segmentiem.Karsējot vai apstrādājot ar sārmu, divpavedienu mērķa DNS vai RNS tiek atdalītas atsevišķās virknēs un pēc tam tiek imobilizētas uz cieta atbalsta.Pēc tam zondi pievieno un hibridizē ar mērķa DNS vai RNS.Tā kā zonde ir marķēta ar izotopu vai neradioaktīvu nuklīdu, mērķa DNS vai RNS var noteikt, izmantojot autoradiogrāfiju vai biotīna-avidīna sistēmu .Tā kā lielākā daļa vīrusu genomu ir klonēti un sekvencēti, tos var noteikt, izmantojot vīrusam specifiskas sekvences kā zondes paraugā.Pašlaik hibridizācijas metodes ietver: dot blot, in situ hibridizāciju šūnās, DNS blotēšanu (DNS) (Southern blot) un RNS blotēšanu (RNS) (Northern blot).
B.PCR tehnoloģija
Pēdējos gados ir izstrādātas vairākas in vitro nukleīnskābju amplifikācijas metodes, kuru pamatā ir PCR, lai pārbaudītu nejutīgus vai nekultivējamus vīrusus.PCR ir metode, kas var sintezēt specifisku DNS sekvenci, izmantojot in vitro polimerāzes reakciju.PCR process ietver trīs posmu termisko ciklu: denaturāciju, atkvēlināšanu un pagarināšanu Augstā temperatūrā (93℃ ~ 95℃) divpavedienu DNS sadala divās atsevišķās DNS virknēs;tad zemā temperatūrā (37℃~60℃) divi sintezēti nukleotīdu praimeri pievienojas komplementārajiem DNS segmentiem;tā kā Taq enzīmam atbilstošā temperatūrā (72 ℃) jaunu DNS ķēžu sintēze sākas no praimera 3' gala, izmantojot komplementāru DNS kā šablonus un atsevišķus nukleotīdus kā materiālus.Tātad pēc katra cikla vienu DNS ķēdi var pastiprināt divās ķēdēs.Atkārtojot šo procesu, katru vienā ciklā sintezēto DNS ķēdi var izmantot kā veidni nākamajā ciklā, un katrā ciklā DNS ķēžu skaits tiek dubultots, kas nozīmē, ka PCR ražošana tiek pastiprināta ar 2n log ātrumu.Pēc 25 līdz 30 cikliem PCR veidošanos nosaka ar elektroforēzes palīdzību, un specifiskos DNS produktus var novērot UV gaismā (254 nm).Specifiskuma, jutīguma un ērtības dēļ PCR ir izmantota daudzu vīrusu infekciju, piemēram, HCV, HIV, CMV un HPV, klīniskajā diagnostikā.Tā kā PCR ir ļoti jutīga, tā var noteikt vīrusa DNS fg līmenī, operācija jāveic ļoti uzmanīgi, lai izvairītos no viltus pozitīvas.Turklāt pozitīvs nukleīnskābes testa rezultāts nenozīmē, ka paraugā ir dzīvs infekcijas vīruss.
Plaši pielietojot PCR tehniku, tiek izstrādātas jaunas metodes un metodes, kuru pamatā ir PCR tehnika dažādiem testu mērķiem.Piemēram, reālā laika kvantitatīvā PCR var noteikt vīrusu slodzi;in situ PCR izmanto, lai identificētu vīrusu infekciju audos vai šūnās;Ligzdotā PCR var palielināt PCR specifiku.Tostarp reālā laika kvantitatīvā PCR ir izstrādāta ātrāk.Daudzas jaunas metodes, piemēram, TaqMan hidrolīzes zonde, hibridizācijas zonde un molekulārā bākas zonde, ir apvienotas reālā laika kvantitatīvā PCR tehnikā, ko plaši izmanto klīniskajos pētījumos.Šo metodi var izmantot ne tikai vīrusu slodzes precīzai noteikšanai pacienta ķermeņa šķidrumā, bet arī zāļu tolerantu mutantu noteikšanai.Tāpēc reālā laika kvantitatīvo PCR galvenokārt izmanto ārstnieciskā efekta novērtēšanā un zāļu tolerances uzraudzībā.
C. Augstas caurlaidības vīrusu nukleīnskābju noteikšana
Lai apmierinātu jaunas infekcijas slimību ātras diagnostikas vajadzības, ir izveidotas dažādas augstas caurlaidības noteikšanas metodes, piemēram, DNS mikroshēmas (DNS).DNS mikroshēmām tiek sintezētas specifiskas zondes un pievienotas mazām silīcija mikroshēmām ļoti lielā blīvumā, veidojot DNS zondes mikroshēmu (DNS), ko var hibridizēt ar paraugu.Hibridizācijas signālu var attēlot ar konfokālo mikroskopu vai lāzera skeneri un tālāk apstrādāt ar datoru, un var iegūt milzīgu datu kopumu par dažādiem gēniem.Ir divu veidu DNS mikroshēmas.“Sintēzes mikroshēma” ir šāda: specifiskie oligonukleotīdi tiek sintezēti tieši uz mikroshēmām.Vēl viena ir DNS kopas mikroshēma.Klonētie gēni vai PCR produkti ir sakārtoti uz slaida.DNS mikroshēmu tehnoloģijas priekšrocība ir liela daudzuma DNS sekvenču vienlaicīga noteikšana.Patogēnu noteikšanas mikroshēmas jaunākā versija var identificēt vairāk nekā 1700 cilvēku vīrusus vienlaikus.DNS mikroshēmu tehnoloģija atrisināja tradicionālo nukleīnskābju hibridizācijas metožu problēmas, un tai ir ļoti plašs pielietojums vīrusu diagnostikā un epidemioloģiskajos pētījumos.
Izlikšanas laiks: 23. decembris 2020